针对细菌滑动夹短肽迭代结构优化

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　 第 1 页 共 10 页 针对细菌滑动夹的短肽的迭代结构优化

　目录 前言................................................................................................................................ 1

　1.

　背景介绍................................................................................................................. 1

　2.

　内容解读................................................................................................................. 2

　2.1.

　概述 .............................................................................................................. 2

　2.2.

　顺序骨架 N-甲基化/-乙基化的影响 .......................................................... 3

　2.3.

　N 端修饰的影响 .......................................................................................... 3

　2.4.

　肽 C 末端位置的变化 .................................................................................. 4

　2.5.

　多种残留物替换对五肽系列影响 .............................................................. 7

　2.6.

　SC 依赖的 DNA 合成、抑制和抗菌活性的设计肽 .................................... 9

　3.

　结论及创新点......................................................................................................... 9

　 前言 本文的通讯作者来自斯特拉斯堡大学分子和细胞生物学研究所的Dominique Y. Burnouf 教授和 Jéro ̂ me Wagner 教授，波尔多大学，欧洲化学与生物学研究所Gilles Guichard 教授，其课题组研究重点是多肽和蛋白质的仿生化学，主要集中在设计和细化具有蛋白质结构和功能的系统，并研究和开发它们的生物和生物医学应用。

　1. 背景介绍 细菌对抗生素的耐药性不仅已经成为一个重大的公共卫生威胁，而且也是一个经济和社会问题，由于新分子的稀缺，细菌耐药性的增加凸显了开发抗生素新方法的必要性。细菌滑动夹(SC)，又称β-钳被认为是开发抗生素的新靶点。该蛋白在细胞分裂过程中对 DNA 复制至关重要，并通过蛋白质-蛋白质相互作用被用作复制性和特异性/转译细菌 DNA 聚合酶的锚定平台。它在细菌种类中具有高度保守的结合位点，而真核细胞中（称为增殖细胞核抗(pcna)），没有序列相似性。EcSC 与其它 SC 结合位点残基具有很高的序列同源性甚至同一性，Kp (100%)、

　 第 2 页 共 10 页 Ab(83%)和 Pa(94%)，因此 EcSC 抑制剂可用于对抗这些危险细菌，并解决抗生素耐药性问题。

　在之前的研究中，作者确定了一条短线性肽序列(5 - 6 个残基)，它与 EcSC结合的解离常数(Kd)为亚微摩尔。在此基础上作者进一步研究了在 N 端和 C 端含有非典型氨基酸和不同化学官能团的序列，以调节疏水性等特性，并增加与蛋白质表面的额外接触。在序列 1 中引入单个修饰，然后研究有益修饰的组合，以观察其亲和性的改善是否具有累加性。最后，在 SC 依赖的 DNA 合成实验中测试了选择的多肽抑制蛋白质与 EcSC 相互作用的能力。

　图 1 多肽 1 的化学结构 2. 内容解读 2.1. 概述 采用等温滴定量热法(ITC)分析五肽 1 与 EcSC 的相互作用，得到 Kd 为 194 nm (ΔG of−9.2 kcal·mol −1 )，与之前确定的 Kd 值吻合良好。最近报道的 EcSC1 和之间的复合体的结构 (PDB ID：6FVL)被用来指导肽的进一步优化。相互作用的分子细节如下图所示，肽涉及五个氢键(HBs)，这些氢键有助于与蛋白质的结合亲和力。Gln 残基的羧酰胺侧链参与一个复杂的 HB 网络，蛋白质中 Met362 的羰基，以及肽(Cha)的第二个残留物的酰胺羰基。

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　图 2 EcSC -肽 1 复合体的晶体结构(1.98 Å) 2.2. 顺序骨架 N-甲基化/-乙基化的影响 系统研究了 N-甲基化对参比肽 1 骨架各酰胺的影响，在 R2(肽 3)和 R4(6)位置引入甲基不利于与 EcSC 的相互作用；证实了 HBs 在这两种酰胺 NHs 和 C=O 之间的重要作用。

　图 3 肽 1 不同 N-烷基化类似物与 EcSC 相互作用的结构、解离常数、热力学和动力学参数 2.3. N 端修饰的影响 结合肽的 N 端残基上的乙酰基先前已经被证明与含有游离胺的肽相比，对EcSC 的亲和力增加了 10 倍，这一结果与 1 的晶体结构以及在 Ac 的羰基和酰胺NH（Arg365）之间观察到的额外 HB 是一致的；将进一步延伸到 N 端(肽 8)，但保持羰基在这个位置，分析了各种基团的影响。

　为了更好地表征这些N端延伸对与蛋白质表面相互作用的贡献，确定了肽8、18、20 和 22 绑定到 EcSC 的共晶体结构。所有这些结构中，肽主干重叠得很好超过 300 个 Cα原子的平均 RMSD 在 0.511 ~ 0.765 Å 之间,Arg365 的 N 端酰基羰基和酰胺 NH 之间的典型 HB 相互作用都被保留。

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　图 4 N 端修饰肽(8− 22)的解离常数，热力学和动力学参数 2.4. 肽 C 末端位置的变化 之前的研究表明，通过优化 sc 结合肽，如 1，对 EcSC 的亲和性可以显著提高例如所述疏水腔的占用率 Phe5 侧链(如芳香环与氯取代基的卤化)。为了进一步了解 EcSC 的序列和亲和力之间的关系，以及调节肽的物理化学性质，作者研

　 第 5 页 共 10 页 究 C 端两个系列修饰的影响，即(i)取代主链羧酸盐(肽 23 - 26)和(ii)通过引入铰链延长肽链残基(肽 27−34)。

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　图 5 ITC 确定肽 1 类似物的结构、解离常数和热力学参数(23 ~ 34)苯丙氨酸残基修饰

　 第 7 页 共 10 页 2.5. 多种残留物替换对五肽系列影响 然后，作者以一种更系统的方式研究了有益的残留修饰组合是否可以添加在结合效力方面。天冬氨酸残基的 N-甲基化具有良好的耐受性，可用于掩盖不必要的 NH 基团，在 C 端和/或 N 端位置，这种修饰与其他修饰系统地结合。结果分析表面 N3 -甲基化和 C 端二氯酸是有效的，在 N 端位置的额外修饰并没有系统地进一步改善相互作用。因此定义一个有效的修饰组合是不容易预测的。

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　图 6 组合不同位置修饰肽（35 – 47）的结构、解离常数和热力学参数

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　图 7 ITC 测定了 48 - 51 六肽解离常数和热力学参数，其中 Oic 残基位于 5 位 2.6. SC 依赖的 DNA 合成、抑制和抗菌活性的设计肽 接下来，作者在体外测试了具有代表性的五肽和六肽 EcSC 配体对复制型大肠杆菌 DNA 聚合酶 IIISC 依赖的 DNA 合成活性的抑制效果，实验结果表明，IC50的测定值与被测肽的结合亲和性之间具有良好的相关性。该系列中最活跃的肽（51）IC50 为 150 nm，比同源肽强 20 倍(1;IC50 = 3.2 μM)抑制蛋白质与 EcSC相互作用和 DNA 复制。用微量肉汤稀释法测定化合物 16、17、30、38、46 和51 对通透性大肠杆菌 D22 细胞的抑菌活性。结果表明，在最高浓度(128 μg/mL)时，化合物均无抑菌活性。尽管进行了化学修饰，但这可能是由于这些肽无法通过细菌膜进入细胞质，正如之前关于化合物 1 的报道。

　3.

　结论及创新点 综上所述，本研究描述了一个结构-亲和性和结构-动力学关系研究的短肽序列，旨在结合和抑制蛋白质与 EcSC 的相互作用。该结构优化方法以与 SC 结合的多肽的 x 射线高分辨率结构分析为指导，从五肽 1 和六肽 27 开始，通过一轮又一轮的修饰实现优化，其中包括在 C-和 N 端位置引入各种修饰，残基替换，肽

　 第 10 页 共 10 页 主干烷基化，序列延伸。在 SC 依赖的 DNA 复制实验中，肽 51 在亚μ m 范围内(IC50 = 150 nm)抑制 DNA 聚合酶 III 的活性，其效价比肽 1 提高了 20 倍。体外抑制 DNA 合成的多肽在浓度≤128 μg/mL 时未表现出抗菌活性，但与 PrAMPs 结合，引入一种策略可以用来将 SC 配体传递到革兰氏阴性菌中，如肽的附加修饰、与铁载体的偶联或膜失稳分子联合。

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